Enea Bastianini assume a liderança na segunda sessão de treinos da MotoGP em Portimão, enquanto Marc Marquez sofre seu primeiro acidente da temporada. Marquez, que até então havia tido apenas um incidente durante os testes e se manteve na moto durante toda a corrida no Catar, caiu no final da sessão. No entanto, isso não teve um impacto significativo em seu desempenho, pois ele garantiu confortavelmente uma vaga no Q2. Bastianini registrou a volta mais rápida em 1m38.057s, mais de dois segundos mais rápido do que a volta anterior de Marquez na primeira sessão de treinos. Jack Miller, da KTM, foi o competidor mais próximo de Bastianini, seguido por Marquez e Jorge Martin, da Pramac. Apesar de uma queda no início, o companheiro de equipe de Miller, Binder, ficou em quinto lugar. Marco Bezzecchi e Maverick Vinales também tiveram ótimas performances, terminando em sexto e sétimo lugar, respectivamente. O campeão reinante, Pecco Bagnaia, inicialmente teve dificuldades para garantir um lugar entre os dez primeiros, mas conseguiu melhorar seu tempo na última volta, terminando em oitavo lugar. Fabio Quartararo e Alex Rins, ambos pilotando Yamaha, completaram o top 10 e se tornaram os primeiros pilotos a se classificar diretamente para o Q2 com motos japonesas nesta temporada. Takaaki Nakagami, da LCR Honda, terminou em 16º lugar, enquanto Pedro Acosta, da Tech3 Gas Gas, foi o piloto mais rápido a ficar de fora da qualificação automática para o Q2. Vários pilotos, incluindo Aleix Espargaro, Alex Marquez, Luca Marini e Franco Morbidelli, sofreram acidentes durante a sessão. O acidente de Morbidelli foi particularmente decepcionante, pois ele havia mostrado um bom desempenho ao longo do dia e poderia ter sido um dos dez melhores.
