Enea Bastianini prend la tête lors de la deuxième séance d’entraînement de MotoGP à Portimão, tandis que Marc Marquez subit son premier accident de la saison. Marquez, qui n’avait eu qu’un seul incident lors des essais et était resté sur sa moto toute la course au Qatar, est tombé en fin de séance. Cependant, cela n’a pas eu un impact significatif sur sa performance, car il a confortablement assuré sa place en Q2. Bastianini a enregistré le tour le plus rapide en 1m38.057s, plus de deux secondes plus rapide que le tour précédent de Marquez lors de la première séance d’entraînement. Jack Miller, de KTM, a été le concurrent le plus proche de Bastianini, suivi de Marquez et Jorge Martin, de Pramac. Malgré une chute au début, le coéquipier de Miller, Binder, a terminé en cinquième position. Marco Bezzecchi et Maverick Vinales ont également réalisé de très bonnes performances, terminant respectivement sixième et septième. Le champion en titre, Pecco Bagnaia, a initialement eu du mal à assurer une place dans les dix premiers, mais a réussi à améliorer son temps dans le dernier tour, terminant huitième. Fabio Quartararo et Alex Rins, tous deux pilotes Yamaha, ont complété le top 10 et sont devenus les premiers pilotes à se qualifier directement pour le Q2 avec des motos japonaises cette saison. Takaaki Nakagami, de LCR Honda, a terminé en 16e position, tandis que Pedro Acosta, de Tech3 Gas Gas, a été le pilote le plus rapide à ne pas se qualifier automatiquement pour le Q2. Plusieurs pilotes, dont Aleix Espargaro, Alex Marquez, Luca Marini et Franco Morbidelli, ont eu des accidents lors de la séance. L’accident de Morbidelli a été particulièrement décevant, car il avait montré de bonnes performances tout au long de la journée et aurait pu être l’un des dix premiers.
