Enea Bastianini asume el liderazgo en la segunda sesión de entrenamientos de MotoGP en Portimão, mientras que Marc Márquez sufre su primer accidente de la temporada. Márquez, que hasta ahora solo había tenido un incidente durante las pruebas y se mantuvo en la moto durante toda la carrera en Catar, se cayó al final de la sesión. Sin embargo, esto no tuvo un impacto significativo en su rendimiento, ya que aseguró cómodamente un lugar en el Q2. Bastianini registró la vuelta más rápida en 1m38.057s, más de dos segundos más rápido que la vuelta anterior de Márquez en la primera sesión de entrenamientos. Jack Miller, de KTM, fue el competidor más cercano a Bastianini, seguido por Márquez y Jorge Martín, de Pramac. A pesar de una caída al principio, el compañero de equipo de Miller, Binder, quedó en quinto lugar. Marco Bezzecchi y Maverick Viñales también tuvieron grandes actuaciones, terminando en sexto y séptimo lugar, respectivamente. El campeón reinante, Pecco Bagnaia, inicialmente tuvo dificultades para asegurar un lugar entre los diez primeros, pero logró mejorar su tiempo en la última vuelta, terminando en octavo lugar. Fabio Quartararo y Alex Rins, ambos pilotando Yamaha, completaron el top 10 y se convirtieron en los primeros pilotos en clasificar directamente para el Q2 con motos japonesas esta temporada. Takaaki Nakagami, de LCR Honda, terminó en el puesto 16, mientras que Pedro Acosta, de Tech3 Gas Gas, fue el piloto más rápido en quedar fuera de la clasificación automática para el Q2. Varios pilotos, incluidos Aleix Espargaró, Alex Márquez, Luca Marini y Franco Morbidelli, sufrieron accidentes durante la sesión. El accidente de Morbidelli fue particularmente decepcionante, ya que había mostrado un buen rendimiento a lo largo del día y podría haber estado entre los diez mejores.
